正確的樣品處理對(duì)于確保 ELISA 檢測(cè)的可靠結(jié)果至關(guān)重要。本文總結(jié)了針對(duì)各種樣品類(lèi)型的推薦步驟，并提供了避免溶血、假陰性和其他干擾因素的特別提示。以下是針對(duì)不同樣品類(lèi)型的推薦步驟摘要。
采集樣品時(shí)的主要考慮因素
-
血清： 采集全血后，在室溫下放置 1 小時(shí)或在 2-8°C 下儲(chǔ)存過(guò)夜。將樣品在 2-8°C 下以 1000× g 離心 20 分鐘，然后收集上清液進(jìn)行檢測(cè)。
-
血漿：考慮到抗凝機(jī)制和下游應(yīng)用，選擇必要的抗凝劑。例如：
-
EDTA（乙二胺四乙酸）：通過(guò)結(jié)合鈣離子防止凝血，適用于免疫學(xué)測(cè)定和細(xì)胞計(jì)數(shù)。
-
肝素：通過(guò)抑制凝血酶和凝血因子來(lái)防止凝血，是生化測(cè)定和蛋白質(zhì)分析的理想選擇。
-
檸檬酸鈉：適合用于凝血實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗芙Y(jié)合鈣離子。
以下是使用 EDTA 的示例：使用真空采集針和無(wú)菌管采集新鮮血液，使用 EDTA-Na? 作為推薦的抗凝劑。在 2-8°C 下以 1000× g 離心樣品 30 分鐘內(nèi)離心 15 分鐘，并收集上清液進(jìn)行檢測(cè)。
-
細(xì)胞培養(yǎng)上清液：將收集的上清液在 2-8°C 下以 1000× g 離心 20 分鐘，以去除顆粒和細(xì)胞碎片。收集上清液進(jìn)行測(cè)試。
-
組織勻漿：用預(yù)冷的 PBS（0.01M，pH=7.4）沖洗組織以去除殘留的血液，稱(chēng)量組織，然后將其切碎。
將切碎的組織加入具有適當(dāng)體積 PBS 的玻璃勻漿器中（通常使用 1：9 w/v 比率）。
在冰上勻漿組織，并通過(guò)凍融或超聲處理進(jìn)一步破壞細(xì)胞。
將勻漿在 2-8°C 下以 5000× g 離心 5-10 分鐘，然后收集上清液進(jìn)行檢測(cè)。
-
細(xì)胞裂解物：用冷 PBS 洗滌貼壁細(xì)胞，然后用胰蛋白酶消化它們。以 1000×g 離心 5 分鐘收集細(xì)胞，然后用冷 PBS 洗滌 3 次。對(duì)于每 10^6 個(gè)細(xì)胞，添加 150-200 μL PBS（必要時(shí)加入蛋白酶抑制劑），通過(guò)凍融或超聲處理裂解。將裂解液在 2-8°C 下以 1500×g 離心 10 分鐘。 收集上清液進(jìn)行測(cè)試。
-
條件培養(yǎng)基：在完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基（含血清）中將細(xì)胞生長(zhǎng)至所需的匯合度。取出生長(zhǎng)培養(yǎng)基，用溫?zé)岬?PBS 洗滌細(xì)胞數(shù)次。更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，并將細(xì)胞孵育 1-2 天。收集培養(yǎng)基并在 4°C 下以 1500 rpm 離心 10 分鐘。上清液可用于檢測(cè)。
-
唾液：在至少 30 分鐘不進(jìn)食、不飲水或不刷牙后收集唾液。將樣品在 2-8°C 下以 4000× g 離心 10 分鐘，以去除雜質(zhì)并收集上清液進(jìn)行檢測(cè)。
-
尿：在無(wú)菌管中收集中游晨尿，在 2-8°C 下以 1000× g 離心樣品 15-20 分鐘以去除碎片，并收集上清液進(jìn)行檢測(cè)。
-
糞便：將樣品與 PBS（0.01M，pH=7.4）以 9 mL/g 的比例混合，在冰上搖動(dòng) 15 分鐘，然后在 2-8°C 下以 5000× 離心 5-10 分鐘。 收集上清液進(jìn)行測(cè)試。
-
骨髓：使用抗凝劑，并在采集后 30 分鐘內(nèi)在 2-8°C 下以 1000× g 離心 15 分鐘。收集上清液進(jìn)行測(cè)試。
-
貧血小板血漿：使用 EDTA、肝素或檸檬酸鹽作為抗凝劑收集血漿。收集后 30 分鐘內(nèi)以 1000× g 離心 15 分鐘。在 2-8°C 下，對(duì) 10,000 × g 血漿進(jìn)行額外離心 10 分鐘，以去除血小板。上清液可用于檢測(cè)。
-
母乳：將樣品在 2-8°C 下以 1000× g 離心 15 分鐘。 收集水性組分并重復(fù)此離心步驟共 3 次。然后可以使用上清液進(jìn)行檢測(cè)。
遵循這些指南可以保持樣品完整性，確保準(zhǔn)確的 ELISA 檢測(cè)結(jié)果。始終將樣品儲(chǔ)存在 -20°C 或更低溫度下，以避免降解并*大限度地減少凍融循環(huán)。對(duì)于人類(lèi)代謝物樣品，應(yīng)特別注意其新鮮度。
樣本收集筆記
-
采集血樣時(shí)應(yīng)盡可能避免溶血。
-
采集抗凝全血后，輕輕倒置試管以確保完全抗凝，防止部分血液未與抗凝劑接觸而導(dǎo)致凝血。
-
在收集組織和細(xì)胞提取物樣品時(shí)，不建議使用市售裂解緩沖液。裂解緩沖液中的表面活性劑可能會(huì)影響分析物的天然構(gòu)象，可能導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果顯著減少或假陰性。此外，由于引入了一種新的溶劑，潛在的基質(zhì)干擾是不確定的，這可能會(huì)增加背景水平并影響測(cè)量準(zhǔn)確度。
-
避免使用高脂血癥樣本。高脂肪樣品含有脂質(zhì)，不是均質(zhì)溶液。如果直接應(yīng)用，它們可能會(huì)干擾抗原抗體結(jié)合，從而影響測(cè)量準(zhǔn)確性。
-
如果要在一周內(nèi)檢測(cè)樣品，請(qǐng)將其儲(chǔ)存在 2-8°C 下。 如果不能及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，請(qǐng)根據(jù)使用量將樣品分裝，并儲(chǔ)存在 -20°C 或 -80°C 下，以避免重復(fù)凍融循環(huán)。
特別提示：導(dǎo)致樣品溶血的原因以及如何避免
在樣品處理中，溶血是指紅細(xì)胞破裂，將血紅蛋白釋放到血清或血漿中。溶血可由各種物理、化學(xué)和毒性因素引起。在體外，機(jī)械攪拌或低溫冷凍會(huì)導(dǎo)致溶血。
溶血發(fā)生后，內(nèi)源性 HRP 酶和血紅蛋白的過(guò)氧化物酶樣活性可導(dǎo)致 ELISA 中不受控制的非特異性染色，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果樣品輕微溶血，建議在與標(biāo)準(zhǔn)品孵育后洗滌板 1-3 次，以盡量減少干擾。如果發(fā)生嚴(yán)重溶血，建議收集新樣本。
為避免溶血影響檢測(cè)結(jié)果，確保靜脈穿刺壓力不要太高，避免采集過(guò)小的血液，輕拿采集的血樣避免劇烈搖晃，不要以過(guò)高的速度離心，及時(shí)將采集的全血加工成血清/血漿，避免凍融全血。如果采血需要麻醉，請(qǐng)使用不會(huì)引起溶血的麻醉劑。
